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本帖最后由 顾汉现 于 2022-3-14 10:35 编辑
研究文章新兴感染
广谱抗病毒药物 GS-5734 可抑制流行性和人畜共患性冠状病毒
蒂莫西 P. Sheahan 1 , * ,艾米 C. 模拟人生1 , * ,雷切尔 L. 格雷厄姆1 ,Vineet D. Menachery 1,丽莎·E·格拉林斯基1 ,詹姆斯 B. 案例2,莎拉河莱斯特1,Krzysztof Pyrc 3 ,乔伊·冯4 ,伊娃·特兰切娃4 ,罗伊班尼斯特4 ,汝进公园4 ,大流士巴布西斯4 ,迈克尔·O·克拉克4 ,理查德 L. 麦克曼4 ,杰米·E·斯潘4,克里斯托弗·A·帕米奥蒂4,达斯汀西格尔4,阿德里安·S·雷4 ,托马斯·奇拉尔4,罗伯特乔丹4 ,马克河丹尼森5 , †和拉尔夫·S·巴里奇1 , †
1美国北卡罗来纳大学教堂山分校流行病学系,教堂山,NC 27599,美国。
2范德比尔特大学医学中心病理学、微生物学和免疫学系,美国田纳西州纳什维尔 37232。
3波兰克拉科夫雅盖隆大学生物化学、生物物理和生物技术学院微生物学系。
4 Gilead Sciences Inc.,福斯特城,CA 94404,美国。
5范德比尔特大学医学中心儿科和病理学、微生物学和免疫学系传染病科,美国田纳西州纳什维尔 37232。
↵ †通讯作者。电子邮件:mark.denison@vanderbilt.edu (MRD);rbaric@email.unc.edu (RSB)
↵ *这些作者对这项工作做出了同等贡献。
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科学转化医学 2017 年 6 月 28 日:
卷。9,第 396 期,eaal3653
DOI:10.1126/scitranslmed.aal3653
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抗病毒药物在冠状病毒上取得了飞跃
与其他新出现的感染一样,冠状病毒可以从动物宿主传播到人群中,造成破坏性影响,例如 SARS 或 MERS 爆发。希汉等人。测试了一种小分子抑制剂,该抑制剂已显示出对埃博拉病毒的活性,可作为用于对抗冠状病毒的潜在药物。这种药物在细胞培养和 SARS 小鼠模型中对多种类型的冠状病毒有效,而且似乎没有毒性。鉴于其广泛的活性,这种抗病毒药物可以用于防止未来冠状病毒爆发的传播,而不管跳过的是哪种特定病毒。
抽象的
新出现的病毒感染难以控制,因为异质成员周期性地循环进出人类和人畜共患病宿主,使特定抗病毒疗法和疫苗的开发复杂化。冠状病毒 (CoV) 具有迅速传播到新宿主物种中并导致严重疾病的倾向。严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 (SARS-CoV) 和中东呼吸系统综合症冠状病毒 (MERS-CoV) 相继出现,在全球范围内引起严重的流行性呼吸道疾病。能够抑制 CoV 感染的广谱疗法将解决当前未满足的医疗需求,并且在治疗新出现的和地方性 CoV 感染方面可能是无价的。我们展示了一种核苷酸前药 GS-5734,目前正在临床开发中用于治疗埃博拉病毒病,50 个值。GS-5734 还对原代人肺细胞中的蝙蝠 CoV、流行前蝙蝠 CoV 和循环的当代人类 CoV 有效,从而显示出广谱抗 CoV 活性。在 SARS-CoV 发病机制的小鼠模型中,GS-5734 的预防性和早期治疗性给药显着降低了肺病毒载量,改善了疾病的临床症状以及呼吸功能。这些数据提供了实质性证据,表明 GS-5734 可能证明对中东流行的 MERS-CoV、流行的人类 CoV 以及可能最重要的未来新兴 CoV 有效。
介绍
基因多样的冠状病毒 (CoV) 家族目前由四个基因组 [1 (alpha)、2 (beta)、3 (gamma) 和 4 (delta)] 组成,感染鸟类和各种哺乳动物。到目前为止,已知只有 CoV 组 1 和 2 会感染人类。尽管 CoV 复制机制表现出大量的校对活动,但病毒基因组 RNA 的复制本质上容易出错,从而推动了遗传相关但多样化的准物种的存在 ( 1 )。大多数 CoV 菌株的宿主范围很窄,但人畜共患病 CoV 具有跳入新宿主物种的倾向(2)。严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 (SARS-CoV) 和中东呼吸系统综合症冠状病毒 (MERS-CoV) 是新出现的冠状病毒的最新例子,它们在免疫学幼稚人群中引起严重疾病。SARS-CoV 于 2002 年在中国广东出现,并在商业航空旅行的帮助下迅速传播到全球,造成 8000 多例病例,死亡率为 10% ( 2 )。2012 年,人们发现 MERS-CoV 进化为通过蝙蝠通过骆驼中间宿主感染人类,导致 1700 多例病例,死亡率接近 40%,与 SARS-CoV 一样,航空旅行已推动全球传播到 27 个国家( 2)。MERS-CoV 在中东流行,沙特阿拉伯王国和肯尼亚的血清学研究表明,人类感染相当频繁(>45,000 人)(3、4)。SARS-CoV 流行于十多年前结束,但已从蝙蝠中分离出几种类似 SARS 的 CoV,它们有效地利用人类血管紧张素转换酶 2 受体,在人类原代气道细胞中复制到高滴度,并且对现有的治疗药物具有抗性抗体和疫苗 ( 5 , 6 )。随着人类和野生动物生态系统重叠的增加,新型冠状病毒进入人类的潜力很大(2)。能够抑制已知人类 CoV 的广谱 CoV 疗法将解决当前未满足的医疗需求,并且在未来出现新的 CoV 时可能是一种宝贵的治疗方法。
目前,尚无批准的针对人类 CoV 的特定抗病毒疗法。尝试使用经批准的抗病毒药物(即利巴韦林和洛匹那韦-利托那韦)和免疫调节剂(即皮质类固醇、干扰素等)治疗 SARS-CoV 和 MERS-CoV 患者,但在随机对照试验中均无效 ( 7 ) . 有效的 CoV 特异性直接作用抗病毒药物 (DAA) 的临床开发一直难以捉摸,尽管有几种保守的可药用 CoV 酶靶标,包括 3C 样蛋白酶、木瓜蛋白酶样蛋白酶和非结构蛋白 12 (nsp12) RNA 依赖性 RNA 聚合酶(RdRp) ( 7 )。2016 年,沃伦等人. 报道了腺苷类似物 GS-5734 的小分子单氨基磷酸酯前药在非人灵长类动物中对埃博拉病毒的体内抗病毒功效 ( 8 )。由于 GS-5734 对埃博拉病毒的作用机制是抑制病毒 RdRp,并且之前的工作表明 GS-5734 的核苷成分对 SARS-CoV 的活性较弱 ( 9 ),因此我们试图评估抗病毒效力和GS-5734 对多种人类和人畜共患病 CoV 的活性广度。
结果
GS-5734 阻止 SARS-CoV 和 MERS-CoV 在人气道上皮细胞中的复制
GS-5734 是一种前药,需要宿主细胞代谢为具有药理活性的三磷酸盐 (TP) 以抑制病毒复制 ( 9 )。为了确定 GS-5734 是否可以抑制高致病性人类 CoV 的复制,我们首先评估了连续人类肺上皮细胞系 Calu-3 2B4 (2B4) ( 10 ) 的抗病毒活性和细胞毒性。GS-5734 抑制 MERS-CoV 在 2B4 细胞中的复制,平均半数最大抑制浓度 (IC 50 ) 值为 0.025 μM(图 1A和图 S1)。我们在高达 10 μM 的浓度下没有观察到任何可测量的细胞毒性(图 1B和图 S1),因此证明 50% 的细胞毒性浓度(CC 50) GS-5734 在 2B4 细胞中超过 10 μM (CC 50 /IC 50 = 治疗指数,>400)。随着1 μM GS-5734的孵育,在48小时处理期间,2B4中GS-5734的药理活性TP的平均细胞内浓度为2.79 μM(图1C)。总之,这些结果表明,在肺中低微摩尔浓度的 TP 将实现对 CoV 复制的显着抑制。
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图。1。
GS-5734 在 2B4 细胞中的 MERS-CoV 抗病毒功效、毒性和代谢。
( A ) GS-5734 对 MERS-CoV 复制的平均抑制百分比。2B4 细胞在不同浓度的 GS-5734 存在下以 0.08 的感染复数 (MOI) 用 MERS-CoV 纳米荧光素酶 (nLUC) 一式三份感染 48 小时,然后通过 MERS-CoV 的定量测量复制-表示 nLUC。( B ) 2B4 细胞的细胞毒性与 (A) 类似。活力通过 CellTiter-Glo 测量。(A) 和 (B) 的数据代表三个独立实验。DMSO,二甲基亚砜。( C) 2B4 细胞中细胞内三磷酸核苷酸 (NTP) 的测量。在三个独立实验中,一式三份的细胞用 1 μM GS-5734 处理并随着时间的推移收获,以通过液相色谱-质谱 (LC-MS) 测量 NTP。
原代人气道上皮 (HAE) 细胞培养物是最具生物学相关性的肺体外模型之一,它概括了人类导气道的细胞复杂性和生理学 ( 11 )。我们评估了 GS-5734 在 HAE 培养物中对 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的抗病毒活性。与未处理的对照相比,在 0.1 μM 时观察到接近 1 log 10的剂量依赖性复制减少,在 1 μM GS-5734 时超过 2 log 10 (图 2,A 和 B),平均 IC 500.069 μM (SARS-CoV) 和 0.074 μM (MERS-CoV) 的值。同时,我们通过定量逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR) 评估了细胞内基因组 [开放阅读框 1a (ORF1a)] 和亚基因组病毒 RNA [开放阅读框核衣壳 (ORFN)] 的丰度。对于 SARS-CoV 和 MERS-CoV,观察到 ORF1a 和 ORFN 的剂量依赖性降低(图 2、C 和 D,以及表 S1),与滴度降低一致。通过显微镜观察,MERS-CoV 感染的 HAE 细胞数量也随着 GS-5734 剂量的增加而减少(图 2E ))。为了评估 GS-5734 在 HAE 中的细胞毒性,我们首先测量了两种不同死亡受体 TNF(肿瘤坏死因子)和 FAS(Fas 细胞表面死亡受体)信号级联中多种促凋亡和抗凋亡因子的转录水平(图 1)。 S2、A 和 B,以及表 S2)。与均匀上调所有测量的细胞凋亡因子转录的阳性对照药物星形孢菌素不同,在抑制 CoV 复制的浓度下,我们没有观察到 GS-5734 处理的剂量依赖性效应。然后,我们通过 CellTiter-Glo 测定在用 10 或 0.1 μM GS-5734 或 DMSO 处理 48 小时的 HAE 中测量细胞毒性。正如所料,GS-5734 处理与 DMSO(CC 50在 HAE > 10 μM 中;治疗指数,>100;无花果。S2C)。为了评估 GS-5734 在另一种原代人肺细胞类型中的细胞毒性,我们将正常人细支气管上皮 (NHBE) 细胞培养物暴露于 GS-5734 或两种已知的细胞毒性化合物嘌呤霉素或星形孢菌素的稀释液中(图 S3)。在 NHBE 中,GS-5734 的平均 CC 50确定为 45 μM,比在 2B4 细胞中观察到的 MERS-CoV 的 IC 50 值 (0.025 μM) 高1800倍,比观察到的 IC 50值高 600 倍HAE 细胞中的 MERS-CoV(0.074 μM)(图 S3、A 和 B)。总之,我们证明了 HAE 对 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的抗病毒功效,其浓度至少比具有可观察到细胞毒性的浓度低 100 倍。
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图 2。
GS-5734 可防止 HAE 细胞中的 SARS-CoV 和 MERS-CoV 复制。
( A ) GS-5734 在原代 HAE 细胞培养物中对 MERS-CoV 的抗病毒功效。HAE 细胞用 MERS-CoV 红色荧光蛋白 (RFP) 在 GS-5734 存在下以 0.5 的 MOI 一式两份感染 48 小时,然后收集顶端清洗液用于病毒滴定。显示了来自三个不同细胞供体的两个独立实验的代表性数据。PFU,斑块形成单位。( B ) GS-5734 在 HAE 细胞中对 SARS-CoV 的抗病毒功效。用 SARS-CoV 绿色荧光蛋白 (GFP) 感染培养物,如 (A) 中所述进行处理和分析。( C ) MERS-CoV ORF1 和 ORFN mRNA 的 qRT-PCR。从 (A) 中的培养物中分离总 RNA 用于 qRT-PCR 分析。( D) 来自 (C) 的细胞中 SARS-CoV ORF1 和 ORFN 的 qRT-PCR,如 (B) 中所述。( E ) HAE 细胞用 MERS-CoV RFP 感染并用 GS-5734 处理,如 (A) 所示。在荧光成像之前,用 Hoechst 33258 对细胞核进行染色。
GS-5734 对 HAE 中的多种人类和人畜共患 CoV 有效
CoV 宿主特异性和进入宿主细胞是由病毒刺突糖蛋白引导的,其广泛的遗传变异反映了宿主物种的多样性和病毒受体使用的变化(图 3A)。相反,CoV RdRp nsp12 在 CoV 之间高度保守,尤其是在基因组内(图 3A),使其成为潜在的广泛适用的药物靶点。
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图 3。
GS-5734 对 HAE 中的多种人类和人畜共患 CoV 有效。
( A ) 由所有四个 CoV 基因组的代表创建的邻接树,显示 CoV nsp12 (RdRp) 和 CoV 刺突糖蛋白的遗传相似性,后者介导宿主向性和进入细胞。病毒株标签的文字颜色对应于左侧的病毒宿主种类。与每个相邻树相邻的热图描绘了针对 SARS-CoV 或 MERS-CoV 的氨基酸同一性百分比(% AA 同一性)。(乙) 上图:GS-5734 在 HAE 细胞中对循环第 1 组人类 CoV (HCoV-NL63) 和来自第 2b 组(HKU3、SHC014 和 WIV1)和 2c (HKU5) 的蝙蝠冠状病毒的抗病毒功效。HAE 细胞在 GS-5734 存在下以 0.5 的 MOI 感染一式两份。48小时后,通过噬斑测定滴定产生的病毒。每个数据点代表每种文化的滴度。底部:来自顶部培养物的总 RNA 中 CoV ORF1 和 ORFN mRNA 的 qRT-PCR。
因为我们观察到对基因组 2 的两个成员(SARS-CoV 和 MERS-CoV)具有抗病毒作用,所以我们试图评估 HAE 细胞中对人类和人畜共患蝙蝠 CoV 的遗传多样性阵列的抗病毒活性的广度。用感染人类 CoV NL63 的 GS-5734 处理 HAE 培养物,人类 CoV NL63 是一种循环的第 1 组人类 CoV,通常会导致支气管炎 ( 12 ),导致0.1 μM 的病毒产量显着减少3 log 10 ,在较高浓度下无法检测到病毒(图. 3B)。同样,GS-5734 治疗抑制了非常多样化的 SARS-CoV 样组 2b(HKU3、WIV1 和 SHC014)和 MERS-CoV 样组 2c(HKU5)蝙蝠 CoV 的复制。其中,WIV1 和 SHC014 作为“流行前毒株”特别受关注,它们可以在没有适应的情况下感染 HAE 培养物,因此准备在人类中出现 ( 5 , 6 )。使用 1 μM GS-5734,蝙蝠 CoV 的传染性病毒产量减少 1.5 log 10至 2 log 10,病毒基因组和亚基因组转录本水平减少 1 log 10至 2 log 10(图 3B ))。总之,这些数据表明 GS-5734 可以抑制广泛多样的 CoV,包括循环人类 CoV、人畜共患病蝙蝠 CoV 和大流行前人畜共患病 CoV。
使用 GS-5734 进行预防性治疗可减少 SARS-CoV 疾病
GS-5734 在小鼠中的血浆稳定性相对较差(即,半衰期,<5 分钟),这是由于人体内不存在分泌的羧酸酯酶 1c ( Ces1c ) 的表达 ( 13 )。在基因缺失Ces1c ( Ces1c -/- )的小鼠中,GS-5734 的血浆稳定性显着增加(半衰期,约 25 分钟;图 S4 )。我们通过感染两种菌株的年龄和性别匹配的小鼠证实,通过体重减轻和肺病毒滴度测量的 SARS-CoV 发病机制在野生型 (WT) C57BL/6J 和Ces1c -/-小鼠中相似(图.S4)。然后我们评估了Ces1c中的药代动力学 (PK) 曲线-/-小鼠皮下给药 50 mg/kg 每天一次 (QD) 或 25 mg/kg 每天两次 (BID)。前药的血浆浓度迅速降低,伴随着短暂暴露于丙氨酸代谢物(Ala-Met)和更持久地暴露于核苷类似物(图4A)。酯酶缺陷小鼠的血浆 PK 曲线与之前报道的猴子相似(8),但代谢物的组织积累在小鼠中的效率降低了约 10 倍,这表明高剂量和相应的血浆暴露对于获得与人类预测的肺 TP 水平相似是必要的。肺中的代谢物谱显示 TP 是主要的细胞内代谢物,建立了对总肺代谢物水平的技术挑战较小的评估,作为 TP 的近似值(图 4B ))。尽管 50 mg/kg QD 和 25 mg/kg BID 均导致目标最大肺水平,但组织活化不仅在小鼠中效率较低,而且 TP 在小鼠肺中的半衰期(约 3 小时)相对较短与在体外人肺细胞或体内非人灵长类动物肺中观察到的结果相比(半衰期,~20 小时;图 S5)。因此,只有 BID 给药方案能够将肺水平维持在 12 到 24 小时之间,这与人类预期的水平一致,并且足以在给药间隔内维持 CoV 抑制(图 4C)。
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