不同针刺量对大鼠脑缺血后突触可塑性的影响

顾汉现

不同针刺量对大鼠脑缺血后突触可塑性的影响


[ 09-09-27 14:46:00 ] 作者：徐振华，许能贵，易玮


【摘要】  【目的】观察不同针刺量对脑缺血后海马齿状回（DG）突触可塑性的影响。【方法】选用Wistar 大鼠36只，随机分为假手术组、缺血模型组、治疗1组（每日针刺1次）、治疗2组（每日针刺2次），采用热凝闭大鼠大脑中动脉法复制局灶性脑缺血模型，治疗1、2组给予电针百会、大椎穴治疗。观察不同针刺次数对脑缺血后DG区突触可塑性的影响。【结果】与假手术组比较缺血模型组兴奋性突触后电位（EPSP）、群峰电位（PS）的输入/输出曲线（I/O曲线）幅度显著降低（P＜005）；与缺血模型组比较治疗1组EPSP、 PS的I/O曲线显著升高（P ＜001或P＜005）, 与假手术组比较无显著性差异（P＞005）。与缺血模型组比较治疗2组EPSP、 PS的I/O曲线显著升高（P＜005），与假手术组比较EPSP的I/O曲线幅度降低（P＜005），而PS的幅度无显著性差异（P＞005）；与治疗1组比较治疗2组EPSP的I/O曲线幅度降低（P＜005），PS的幅度无显著性差异（P＞005）。EPSP的长时程增强（LTP）幅度缺血模型组较假手术组显著升高（P＜005），两个治疗组较假手术组显著升高（P＜005），与缺血模型组比较及组间比较均无显著性差异（P＞005）。PS的LTP幅度缺血模型组较假手术组显著降低 （P＜005），两个治疗组显著高于缺血模型组（P＜005），与假手术组比较及组间比较均无显著性差异（P＞005）。EPSP的长时程抑制（LTD）幅度缺血模型组较假手术组降低 （P＜005），两个治疗组EPSP的LTD幅度较假手术组显著降低 （P＜005），与缺血模型组比较及组间比较均无显著性差异（P＞005）。缺血模型组PS的LTD幅度与假手术组比较无显著性差异（P＞005），治疗1组PS的LTD幅度与假手术组比较显著升高（P＜005），与缺血模型组比较无显著性差异（P＞005）；治疗2组与其他3组比较均无显著性差异（P＞005）。【结论】针刺对缺血引起的海马DG区EPSP、PS的I/O曲线幅度变化起保护作用，能修复缺血造成的海马DG区PS的LTP诱导的损害，而不同针刺量对改变脑缺血后海马的LTP诱导方面的作用无显著性差异。

【关键词】  脑缺血/针灸疗法；突触可塑性；疾病模型，动物；大鼠；穴，百会；穴，大椎

突触是神经元之间信息传递和加工的关键结构，在脑和脊髓中，整个神经元表面积（包括胞体、树突和轴突）有60%～80%的部位被突触所占据。突触可塑性一般即指突触传递的可塑性，突触可塑性是脑可塑性的主要表现，皮层联络纤维的突触可塑性是皮层图重建的基础［1-3］。前期研究表明［4］针刺能阻止由永久性的大脑中动脉闭塞缺血造成的缺血同侧海马DG区基本的突触传递降低和单脉冲刺激海马穿通纤维引起的齿状回颗粒细胞的共同发放幅度的降低，消除缺血对海马DG区突触传递造成的损害；能明显改善由永久性大脑中动脉闭塞造成的海马突触传导效率的损害。针刺是治疗脑缺血疾病的有效方法之一，但对针刺治疗脑缺血的时机选择、治疗间隔时间、留针时间、疗程等尚存在争议［5］。本研究观察了不同针刺次数对脑缺血海马突触传递效率的影响，以探讨针刺治疗脑缺血的最佳参数。现报道如下。

    1材料和方法

    11动物健康雄性Wistar大鼠36只（由中国科技大学生命科学院动物房提供，实验动物机构许可证号：D010203），体质量210～290g，鼠龄8～10周。用普通颗粒型大鼠饲料（质量分数为蛋白23%，脂肪47%，钠盐024%）喂养，饮用自来水。室温18℃～26℃，湿度60%～80%，光暗周期12h。由抽签法随机分为假手术组﹑缺血模型组、治疗1组和治疗2组，每组9只。

    12主要仪器电热灼器（932型，上海医疗器械八厂）；30号1寸毫针（华佗牌，苏州医疗用品厂）；电针仪（805A Ⅱ 型，广东汕头市医用设备厂）；立体定位仪（江湾 Ⅰ 型，上海第二军医大学）。

    13模型复制采用热凝闭大脑中动脉法复制局灶性脑缺血模型［6］。以100mg/L水合氯醛溶液，按400mg/kg腹腔注射麻醉，然后取右上侧卧位固定，沿耳—眼连续中点切开皮肤，分离颞肌，暴露颞骨作一骨窗，轻抬脑，显露大脑中动脉，用烧红的电热灼器轻触大脑中动脉，使之凝闭，复制局灶性脑缺血模型。其中假手术组手术时只暴露大鼠大脑中动脉，不予凝闭。治疗组立即给予电针治疗。

    14治疗方法

    141穴位选择穴位选取督脉经穴“百会”、“大椎”，其定位参照大鼠的常用针灸穴位［7］：“百会”穴位于顶骨正中；“大椎”穴在第7颈椎与第1胸椎间，背部正中。

    142刺法治疗1组大鼠以30号1寸毫针斜刺入百会05寸，直刺入大椎05寸，将针柄分别连接至电针仪上，5~10Hz，疏密波，强度以大鼠安静耐受为度，一般3~5V，时间30min，每天1次，均在上午10点左右进行，治疗2组于每天下午3时左右再治疗1次，参数同前，均连续治疗2周。而假手术组和缺血模型组大鼠只在同等条件下饲养，未予任何处理。

   15神经功能缺损评分（sNS)待大鼠苏醒后（术后3h)及2周后分别观察大鼠行为表现并进行神经功能缺损评分。方法：温和地提起动物尾巴，悬于地面上方1m高处；置于地面，轻轻侧推其肩胛部，参照Bederson等［8］的评分方法行神经检查等级评分，评估大脑中动脉阻断后大鼠的神经损伤状况，3h时段缺血模型组与治疗组评分1分以下者剔除，不作为观察对象。评分标准：0分为向地面伸展两前肢，未见行为异常；1分为脑损伤对侧前肢持续地屈曲；2分为脑损伤对侧前肢屈曲，脑损伤对侧肩内收但无扭转，侧推抵抗力弱；3分为脑损伤对侧前肢屈曲，脑损伤对侧肩内收有扭转，侧推无抵抗力。

    16麻醉、固定和手术造模14d后，大鼠以100g/L乌拉坦溶液（18g/kg腹腔注射)麻醉，药量不够可酌情补加10%。将麻醉后的大鼠固定在立体定位仪上，固定耳杆和上门齿，调整动物向上倾约18°~22°，此角度每次实验都需要重新测定，以确保电极是垂直插入。在缺血同侧用剪刀小心剪开皮肤，暴露头骨，在电极要插入部分标记并打孔，孔径25mm×25mm，分别去除碎骨片、硬脑膜和软脑膜，暴露皮层，并滴入生理盐水和石蜡油（以使皮层在实验过程中保持湿润）。体温维持仪测定动物体温，在实验过程中维持体温在（37±1）℃，心电经前放大器放大后，在示波器上显示。

    17刺激和记录刺激电极为双极电极，用两根彼此接近但又相互绝缘（尖端除外，尖端直径约100μm）的钢丝构成，尖端相距约03mm，插入位点在海马穿通纤维角状束，相对于颅骨立体定位坐标：以人字缝为零点，向后约78mm，中线偏右44mm，插入深度约28~30mm。记录电极是用2mol/LNaCl灌制的玻璃微电极，尖端约3~5μm,阻抗1~3兆欧，用来记录细胞外场电位反应，插入位点是海马齿状回颗粒细胞，相对于颅骨立体定位坐标：人字缝向后约38mm，中线偏右20~22mm，插入深度约20~40mm。

    18反应波形测定用单脉冲刺激海马穿通纤维，在海马齿状回颗粒细胞记录反应波形，利用微电极推进器，控制电极缓慢下插（10 μm/次），当微电极到达齿状回颗粒细胞区时可以记录到负向、延迟很短的场电位，称为兴奋性突触后电位（EPSP）。随电极的下插，负向EPSP逐渐消失，代之以正向EPSP，主要在颗粒细胞的体层中记录。一般以负向到正向的EPSP反转点为标准，向下插约150~200μm时，即可在计算机上看到一系列的反应波形，选取其中幅度较大、波形较好且较稳定的波形。

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    19实验参数的测定

    191输入/输出曲线（I/O曲线）测定单脉冲的I/O曲线。利用正向或负向方波（mA×02ms)刺激海马穿通纤维，低强度刺激时出现正向单突触EPSP，是由于激活了穿行于齿状回颗粒细胞之间的穿通纤维突触，引发小的较弱的兴奋性突触后电位，此电位不能达到颗粒细胞兴奋所需要的阈值。随着刺激强度的增大，齿状回颗粒细胞达到动作电位阈值，引发颗粒细胞发放，从波形上可以看到一负向峰叠加在正向EPSP上，其为群峰电位（populationspike,PS),反映了刺激穿通纤维在海马齿状回颗粒细胞所产生的动作电位总和。刺激强度逐渐加大，直到10mA为止。每一个刺激强度都要求采用3次波形值以作平均。刺激频率为0125Hz。EPSP和PS幅度按Gilbert和Mack［9］等方法计算：EPSP幅度一般为反应开始约10ms的固定间隔点到PS发放前约05ms的上升相的两点间斜率来计算（mV/ms),这样计算是为了防止PS对EPSP的干扰。PS幅度为峰—峰间连线的中点到波谷间的距离（mV)。

    192长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）记录LTP，在测定I/O曲线后，选定能产生最大反应的40%幅度的刺激强度，使用这个刺激强度来观察在强直刺激后所能产生的增强效应。强直前，以单脉冲刺激强度所产生的反应为基线（baseline),采集约05h，达到稳定。产生LTP的刺激参数如下：主间隔1s，即每隔给一串刺激，串包括250Hz×10个，波宽02ms，共给11个串。强直刺激后恢复单脉冲刺激并记录1h。LTP记录完后，再记录LTD，首先记录I/O2、双脉冲曲线（ppf2)，基线记录30min后，低频刺激（LFS：1Hz、15min)诱导LTD，低频刺激后恢复单脉冲刺激并记录至少45min。

    110统计学方法神经功能缺损评分采用SPSS110版统计软件包进行统计，各组间差异采用方差分析，继以LSD检验；假手术组和缺血模型组EPSP、PS差异用t检验，每组各有6只大鼠进入最后统计分析。

    2结果

    21不同刺激量针刺对脑缺血后大鼠神经功能缺损的影响大鼠神经功能缺损的评价结果表明，缺血模型组和治疗组动物在大脑中动脉阻断后3h即出现神经功能缺损体征，神经功能分级评价大鼠的神经功能缺损均为2~3分。随着缺血时间的延长，缺血模型组动物神经缺损症状逐渐减轻；3h与14d时相的神经功能缺损评分比较具有显著性差异（P＜001），表明大鼠脑缺血后有一定的自我恢复能力；两个治疗组缺血3h时与缺血模型组同一时段神经功能缺损评分比较无显著性差异（P＞005）；缺血后14d时两个治疗组神经功能缺损评分显著优于缺血模型组（P＜001),与假手术组比较无显著性差异(P＞005)，说明不同针刺量在对大鼠神经功能缺损恢复方面均有较好疗效，而两治疗组间作用无显著性差异(P＞005)。结果见表1。表1各组大鼠神经功能缺损评分比较Table 1Comparison of score of  hyponeuria

    in different groups（x±s)sNS组别N缺血时间t=3ht=14d假手术组600缺血模型组6233±052117±041①治疗1组6217±041033±052②③治疗2组6233±052017±048②④①P＜001，与缺血模型组（3h)比较；②P＜001,与同时段缺血模型组比较；③P＜001，与治疗1组（3h）比较；④P＜001，与治疗2组（3h）比较

    22不同刺激量针刺对脑缺血后缺血同侧海马DG区I/O曲线的影响在诱导LTP之前用单脉冲测得各组的I/O曲线见图1。与假手术组比较缺血模型组EPSP的I/O曲线幅度显著降低（P＜001），PS幅度也显著降低（P＜005），表明缺血能降低海马DG区基本的突触传递，同时降低单脉冲刺激海马穿通纤维引起的齿状回颗粒细胞的共同发放幅度。与缺血模型组比较治疗1组EPSP的I/O曲线显著升高（P＜001），PS的幅度也显著升高（P＜005），与假手术组比较无显著性差异（P＞005);与缺血模型组比较治疗2组EPSP的I/O曲线显著升高（P＜005），PS的幅度也显著升高（P＜005），与假手术组比较EPSP的I/O曲线幅度降低（P＜005），而PS的幅度无显著性差异（P＞005）；治疗2组和治疗1组比较EPSP的I/O曲线幅度降低（P＜005），PS的幅度无显著性差异（P＞005），表明针刺对缺血引起的海马DG区EPSP、PS的I/O曲线幅度变化起保护作用，治疗2组改变EPSP I/O曲线幅度的作用低于治疗1组。

    23不同刺激量针刺对脑缺血后缺血同侧海马LTP的影响分别给予假手术组、缺血模型组、治疗1组和治疗2组强直刺激，连续记录强直刺激后的EPSP和PS1h，并和强直刺激前比较（以强直刺激前为100%）。一般在强直刺激后1h内能产生稳定的LTP。图2a显示EPSP的LTP幅度在假手术组为（109±38）%，缺血模型组升高为（114±19）％，与假手术组比较显著升高（P＜005）。治疗1组为（116±18）%，与假手术组比较显著升高（P＜005），与缺血模型组比较无显著性差异（P＞005）。治疗2组为（118±005）%，与假手术组比较显著升高（P＜005），与缺血模型组、治疗1组比较无显著性差异（均P＞005）。图2b显示PS的LTP幅度在假手术组为（201±13）%，在缺血模型组显著降低为（179±13）%（P＜005）；治疗1组升高为（215±98）%，显著高于缺血模型组（P＜001），与假手术组比较无显性著差异（P＞005）；治疗2组升高为（200±128）%，显著高于缺血模型组（P＜005），与假手术组、治疗1组比较无显著性差异（均P＞005），表明电针能修复缺血造成的海马DG区PS的LTP诱导的损害，而不同针刺量在改变脑缺血后海马的LTP诱导方面无显著性差异（P＞005）。

    24不同刺激量针刺对脑缺血后缺血同侧海马DG区LTD的影响记录LTP后，再记录LTD，首先记录I/O2、ppf2,基线记录30min,低频刺激15min后，连续记录低频后的EPSP和PS45min，并和低频刺激前比较（以低频刺激前为100%）。图3a显示EPSP的LTD幅度在假手术组为（987±34）%，缺血后显著降低为（891±355）%，与假手术组比较有显著性差异（P＜005）；治疗1组为（8677±204）%，与假手术组比较有显著性差异（P＜005），与缺血模型组比较无显著性差异（P＞005）；治疗2组为（8657±159）%，与假手术组比较显著降低（P＜005），与缺血模型组、治疗1组比较无显著性差异（均P＞005)。图3b显示PS的LTD幅度在假手术组为（847±53）%，在缺血模型组为（856±39)%, 与假手术组比较无显著性差异（P＞005）；冶疗1组升高为（8965±281）%，与缺血模型组比较无显著性差异（P＞005）；治疗2组为（9019±313）%，与其他3组比较无显著性差异（均P＞005）。表明缺血损伤了海马DG区EPSP的LTD诱导，而对PS的LTD诱导没有明显影响；不同刺激量的针刺对海马DG区的LTD诱导无明显影响。

　　3讨论

　　脑血管病是当前危害人类生命与健康的常见病，是中老年人致死、致残的主要原因，近年来呈逐年上升的趋势。其中缺血性脑血管病的发病率约为出血性脑血管病的3倍［10］，如何提高脑缺血疾病的治疗效果是迫切需要解决的问题。针灸是治疗脑缺血的有效方法之一，然而临床治疗脑缺血的介入时机、刺激量、留针时间及疗程等方面尚存争议［5］，有待于进一步研究。我们在临床工作中发现针刺具有即时性效应，即一次针刺的效应随着时间的推移而产生发展、高峰、回落、衰弱的过程，一次针刺时间持续效应约在7h左右，因此，研究2次针刺之间的时间间隔应是提高脑缺血疾病疗效的突破点之一［11］。利用头针治疗偏瘫的研究表明每日针刺2次组在提高肌力方面比每日针刺1次组效果好［11］。利用头穴治疗偏瘫的研究表明每日针刺2次组在肌力改善、血清胆碱酯酶活力方面明显优于每日针刺1次组［12］。利用头穴治疗脑缺血每日针刺3次组效果明显优于针刺2次组，并较针刺2次组明显改善血液流变学的各项指标［13］。观察连续留针12h，在6h行针一次对急性脑梗塞患者肌力的影响，结果表明效果明显优于普通治疗组［14］。我们的研究表明［15］：针刺治疗中风每日针刺2次组疗效明显优于每日针刺1次组，在一定的时间内提高针刺的刺激量能明显提高疗效。脑的可塑性和功能重组是脑卒中康复的主要机制，突触可塑性是脑可塑性的主要表现。突触可塑性是皮层联络纤维的突触可塑性,是皮层图重建的基础，长时程增强和长时程抑制是突触可塑性的两种主要表现形式［16］，因此为了研究不同针刺刺激量对脑缺血后脑可塑性的影响，我们观察了针刺不同次数对脑缺血后突触传递长时程增强和长时程抑制的影响。本观察结果表明，每日针刺2次与每日针刺1次组比较在改善脑缺血后海马的突触传递方面无显著性差异，因为脑缺血对海马的影响并不是一种直接的影响，每日针刺1次即能明显改善由永久性大脑中动脉闭塞造成的缺血同侧海马突触传导效率的损害，因此这个结果并不能说明不同的针刺量对脑缺血后脑的可塑性的影响没有区别。我们将进一步研究针刺不同次数对脑缺血灶周围脑组织的突触传递的影响，以探讨不同针刺量对脑缺血后功能恢复影响的机理。

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