脑缺血损伤大鼠海马区钙结合蛋白的变化及针刺对其影响

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脑缺血损伤大鼠海马区钙结合蛋白CalbindinD28k蛋白表达的变化及针刺对其影响


[ 09-09-27 11:17:00 ] 作者：马惠芳 任秀君


【摘要】  　　[目的]观察针刺对脑缺血损伤大鼠大脑海马区钙结合蛋白CalbindinD28k蛋白表达及神经行为学的影响。[方法]选用雄性SD大鼠，随机分为空白对照组、脑缺血模型组、针刺治疗组，每组10只，采用化学刺激诱导血栓性闭塞大脑中动脉手术复制大鼠局灶性脑缺血模型;针刺组采用针刺百会、水沟穴，每天1次，治疗7d;治疗结束后，采用免疫组化方法观察针刺前后大鼠海马区CalbindinD28k蛋白表达的变化，造模后1～2h及治疗结束后分别对各组大鼠进行神经行为学评分。[结果]大鼠局灶性脑缺血后CalbindinD28k阳性细胞表达显著减少(与空白对照组比较，P<0.05)，针刺后大鼠大脑海马区CalbindinD28k阳性细胞表达显著增加(与脑缺血模型组比较，P<0.01)。大鼠在造模后1～2h的神经症状行为评分均有阳性反应，与空白对照组比较差异均有显著性意义(P<0.01)，针刺治疗组大鼠在治疗前后的神经症状行为评分差异也有显著性意义(P<0.01)。[结论]针刺可上调CalbindinD28k蛋白的表达，减轻细胞内Ca2+ 超载，可能是针刺保护脑缺血损伤的机制之一。

【关键词】  脑缺血/针灸疗法 脑组织/病理学 疾病模型 动物 大鼠 穴 百会 穴 水沟

　　在脑缺血损伤过程中，细胞内Ca2+ 超载是引起细胞凋亡的主要诱导因素之一，Ca2+通道阻滞剂等对动物缺血再灌注模型具有良好的脑保护作用[1]。有研究认为[2]局灶性脑缺血时钙结合蛋白CalbindinD28k在半影区表达上调可能是神经元自我保护机制之一，以缓冲及运输细胞内蓄积的Ca2+。电针对缺血性神经损伤具有保护效应，本文采用免疫组化法观察了CalbindinD28k对局灶性脑缺血大鼠大脑神经元的保护作用及针刺对CalbindinD28k蛋白表达的影响，现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组 健康成年SD大鼠，清洁级，雄性，体质量(200±20)g，购于北京维通利华公司实验动物中心。许可证编号：SGXK(京)20022003。动物适应性喂养3d后随机分为空白对照组、脑缺血模型组、针刺治疗组，每组10只。

　　1.2 主要试剂与仪器 CalbindinD28k免疫组化试剂盒由北京中杉试剂公司提供，产地美国;CMIAS2001A型多功能真彩色病理图像分析系统，由北京煤炭总医院提供。

　　1.3 模型制作 按Tamura等[3]的方法稍加改进。将大鼠用100mg/L水合氯醛(0.35mL/kg)腹腔麻醉后，左侧卧位，于眼眶后至耳的中点纵行切开皮肤约2cm，分离并切去部分颞肌，暴露颞骨，做一直径约3～5mm的骨窗，轻抬脑，可见到横过嗅束向上走行的大脑中动脉(MCA)，将浸有500mg/L FeCl3(用 0.1mol/L HCl配置) 溶液10μL的定量滤纸敷于暴露的MCA上20min。术区洒适量庆大霉素液，然后缝合皮肤，再于术口处局部使用青霉素粉少许消炎抗菌。

　　1.4 治疗方法 空白对照组每天抓取本组大鼠1次，不做其他处理。脑缺血模型组施以化学刺激诱导血栓性闭塞大脑中动脉手术复制局灶性脑缺血模型，每天于治疗组进行治疗时抓取本组大鼠，但不予任何治疗，7d后处死取材。针刺治疗组施以化学刺激诱导血栓性闭塞大脑中动脉手术，术后24h开始针刺百会、水沟穴，百会穴平刺2mm捻转1min，留针20min;水沟穴点刺1mm，捻转1min不留针，均每天1次，治疗7d后处死取材。

　　1.5 取材 动物存活期满后，以100mg/L水合氯醛(0.35mL/kg)麻醉，迅速断头开颅取全脑置于体积分数10%甲醛液中固定1周。脑组织经常规步骤处理，石蜡包埋，切片，片厚4μm，常温保存备用。

　　1.6 神经行为学评分 于造模苏醒后(大约1h)和完成全部治疗处死前分别对各组大鼠进行神经症状行为评分。参照Bederson等[4]的方法并加以改进，对造模动物进行行为学评分。评分方法：①提鼠尾离开地面约30cm，观察前肢屈曲情况。如双前肢对称伸向地面，记为0分;如手术对侧前肢出现肩屈曲、肘屈曲、肩内旋或既有肩肘的屈曲又有内旋者，记为l分。②将动物置于平滑地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力记为0分;如向手术对侧推动时阻力下降者，记为1分。③将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。双侧肌张力对等且有力者为0分;手术对侧前肢肌张力下降者记为1分。④提鼠尾离开地面约30cm，动物有不停地向手术对侧旋转者，记为1分。根据以上标准评分，1～4分为有效模型。满分为4分，分数越高，动物行为障碍越严重。

　　1.7 脑组织CalbindinD28k阳性细胞数检测 采用免疫组化法检测。具体步骤如下：①组织切片常规脱蜡至水，蒸馏水冲洗，磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡5min;②体积分数3%H2O2去离子水，室温下放置5～10min，以灭活内源性过氧化酶活性;③滴加正常山羊血清封闭液，室温10～15min，甩去多余液体，不洗;④滴加适当稀释的CalbindinD28k一抗(兔IgG)，4℃过夜，PBS(pH 7.2～7.6)冲洗3min×3次;⑤滴加生物素标记山羊抗兔IgG，20℃～37℃下放10～15min，PBS 冲洗，3min×3次;⑥滴加三抗辣根酶标记链霉卵白素工作液，20℃～37℃下放置10～15min，PBS冲洗，3min×3次;⑦滴加显色剂联苯二胺(DAB)显色，显色时间10～30min;蒸馏水洗涤，封片镜检;⑧阴性对照：切片省略第5步，其他处理同上;⑨普通光镜观察、照相。采用多功能真彩色病理图像分析管理系统对脑组织切片进行定量分析。每只动物于海马区各选3张切片，每张切片随机选取10个视野。观察并对阳性细胞数进行计数分析(每10个观察细胞中阳性细胞所占比例)。

　　1.8 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析。

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　　2 结果

　　2.1 3组大鼠神经症状行为评分比较 表1结果显示，大鼠在造模后1～2h的神经症状行为评分均有阳性反应，与空白对照组比较差异均有显著性意义(P<0.01)，说明局灶性脑缺血模型造模成功。针刺治疗组治疗前后比较及与模型组比较神经症状行为评分差异均有显著性意义(P<0.01)，说明针刺对局灶性脑缺血大鼠具有显著的治疗作用。表1 各组大鼠神经行为症状评分比较

　　统计方法：单因素方差分析;①P<0.01，与空白对照组比较;②P<0.01，与造模后1h比较;③P<0.01，与脑缺血模型组比较

　　2.2 针刺对脑缺血模型大鼠脑组织海马区CalbindinD28k表达的影响 表2、图1结果显示，空白对照组大鼠海马区组织切片中可见散在CalbindinD28k阳性细胞表达，脑缺血模型组在造模7d后，海马区CalbindinD28k阳性细胞的表达显著减少，与空白对照组比较差异有显著性意义(P<0.05);针刺治疗组经针刺治疗后海马区CalbindinD28k阳性细胞表达显著增多，与脑缺血模型组比较差异有显著性意义(P<0.01)。表2 各组大鼠脑组织海马区CalbindinD28k阳性细胞数比较

　　3 讨论

　　水沟与百会穴是临床治疗中风病的常用穴。水沟属督脉，为手足阳明之会。督脉循行于脊里，入络于脑，与脑和脊髓有密切的联系。《千金翼方》："卒中风口噤不开，鼻交额中一穴，针入六分，得气即泻……"。百会属督脉，手足三阳、督脉交会穴，开窍醒脑，回阳固脱。水沟、百会相配可醒脑开窍，回阳救逆。前期研究观察了水沟与百会对脑缺血大鼠的治疗作用，并得出肯定结论[5-6]。

　　Ca2+超载对脑缺血的损伤作用已得到公认。钙结合蛋白CalbindinD28k作为神经细胞内一种钙离子鳌合剂，近年来引起了人们的广泛关注，Mattson等[1]研究表明在对兴奋性氨基酸及钙离子运载体的反应中,CalbindinD28k可下调胞内游离钙水平,由此推测CalbindinD28k可通过下调钙离子水平而阻抑Ca2+介导的细胞死亡。Lowenstein等[7]研究了CalbindinD28k在脑缺血过程中的作用，发现大鼠全脑缺血后6～12h CalbindinD28k mRNA升高达到高峰。Kindy等[8]用腺病毒表达CalbindinD28k的实验证实了其在脑缺血时具有保护海马CA1区神经元的作用。Yenari等[9]也已经通过侧脑室注射病毒载体的方法证实CalbindinD28k对动物局灶性脑缺血的脑保护作用。

　　本研究结果表明，脑缺血损伤后，脑缺血模型组大鼠海马区CalbindinD28k的表达显著减少，与空白对照组比较有显著性差异;针刺治疗组大鼠海马区CalbindinD28k的表达增加，说明针刺可上调海马区CalbindinD28k蛋白的表达，调节细胞内的Ca2+水平，减轻Ca2+的超载，可能是其保护脑缺血损伤的机制之一。

【参考文献】
  　　[1]Mattson M P,Rychlik B,Chu C,et al.Evidence for calciumreducing and excitoprotective roles for the calciumbinding protein CalbindinD28k in cultured hippocampal neurons[J].Neuron,1991,6(1):41.

　　[2]张京钟,施静,刘晓春,等.电针对大鼠局灶性脑缺血脑内CalbindinD28k表达的影响[J].中国针灸,2002，22(1):43.

　　[3]Tamura A，Graham D I，Mcculloch J，et al.Focal cerebral ischemia in rats：Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion[J].J Cereb Blood Flow Metab,1981,1(1):53.

　　[4]Bederson J B，Bitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:Evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986,17(3):472.

　　[5]马惠芳,孙华,任秀君,等.电针"水沟"与"井穴"对全脑缺血大鼠脑组织钙调素活性影响的对比研究[J].针刺研究，2002,27(2):102.

　　[6]马惠芳,任秀君,王小宁,等.针刺对高血脂合并脑缺血大鼠海马区Bcl2、Bax蛋白表达的影响[J].针刺研究,2006,31(4):212.

　　[7]Lowenstein D H，Gwinn R P，Seren M S，et al.Increased expression of mRNA encoding CalbindinD28k，the glucose regulated protein， the 72k Da HSP in three models of acute CNS injury[J].Brain Res Mol Brain Res,1994,22(1～4):299.

　　[8]Kindy M S,Yu J,Miller R J,et al.Adenoviral vectors in ischemic injury.In:Krieglstein J.Pharmacology of Cerebral Ischemia[M].Stuttgart,Germany:Medpharm Scientific Publishers,1996:525.

　　[9]Yenari M A,Sun G H.CalbindinD28k overexpression protects striatal neurons from transient focal cerebral ischemia[J].Stroke,2001,32(4):28.