银杏黄酮苷元对内皮细胞低密度脂蛋白受体-1表达的影响

顾汉现

银杏黄酮苷元对内皮细胞植物血凝素样低密度脂蛋白受体-1表达的影响


[ 10-02-06 09:44:00 ]  作者：何艳，付永昕，吴立荣，方颖，李安敏，陈云


【摘要】  目的： 探讨银杏黄酮苷元对氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)诱导脐静脉内皮细胞株ECV304植物血凝素样低密度脂蛋白受体-1（Lectinlike oxidized low density lipoprotein receptor1，LOX1）表达的调节作用。方法： 应用逆转录聚合酶链式反应、SP免疫组织化学法，探讨oxLDL诱导下内皮细胞表达LOX1及银杏黄酮苷元的干预作用。结果： 6.25～25 mg/L银杏黄酮苷元与脐静脉内皮细胞株ECV304共同培养6～48 h可显著抑制oxLDL诱导的内皮细胞LOX1mRNA和蛋白表达（P<0.05），具有浓度、时间效应关系(P<0.05)；LOX1拮抗剂聚肌苷酸可抑制oxLDL诱导的内皮细胞LOX1mRNA和蛋白表达(P<0.05)。结论： oxLDL可能通过LOX1导致内皮功能障碍，银杏黄酮苷元可显著抑制oxLDL诱导的内皮细胞LOX1表达，这可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一。

【关键词】  受体，LDL； 银杏； 黄酮类； 内皮，血管

　　［Abstract］ Objective: To investigate the regulating effects of ginkgetin aglycone (GA) on oxidized low density lipoprotein (oxLDL) induced gene and protein expression of lectinlike oxidized low density lipoprotein receptor1 (LOX1) in human umbilical vein endothelial cell line 304 (ECV304).Methods: RTPCR and SPimmunohistochemistry assay were used to detect the expression of LOX1 in endothelial cells under the induction of oxLDL and the intervention effect of GA. Results: The expression of LOX1 mRNA and its protein was inhibited significantly when ECV340 cells were incubated with 6.25～25 mg/L GA for 6～48 hours（P<0.05）, and to some extend, the inhibitory effect appeared dependant on the drug concentration and action time （P<0.05）. LOX1 receptor inhibitor, polyinosinic acid showed inhibition to the expression of LOX1 mRNA and protein induced by oxLDL (P<0.05). Conclusions: Endothelial dysfunction could be caused by oxLDL through LOX1, and GA can inhibit significantly the expression of oxLDL induced LOX1, which may be one of its antiatherosclerosis mechanisms.

　　［Key words］lipoprotein LDL recepters; Ginkgo biloba; flavones; endothelium,vascular
   
　　氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）导致内皮功能障碍在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）病理过程中起关键作用[1]，植物血凝素样低密度脂蛋白受体-1（Lectinlike oxidized low density lipoprotein receptor1，LOX1）作为近期发现的主要在内皮细胞表达的oxLDL特异性受体，介导了oxLDL对内皮细胞的损伤作用[2]。银杏黄酮苷元（Ginkgetin Aglycone，GA）是通过酸水解-重结晶法去除单糖后获得的新型银杏叶提取物（Ginkgo Biloba Extract，GBE ），与传统GBE比较，GA具有较强的脂溶性和体内生物效价高的特点。目前，国内外对GBE防治动脉粥样硬化的实验研究和临床应用很多，但对GA的研究却很少。本研究在培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304上观察了不同浓度GA、作用不同时间对oxLDL所致的内皮细胞表面LOX1异常表达的干预，以期为GA进一步用于临床防治AS性疾病提供实验依据。

　　1  材料与方法

　　1．1  试剂及仪器

　　人脐静脉内皮细胞株ECV304（中国典型培养物保藏中心），氧化低密度脂蛋白（中山大学谢志忠博士提供），DMEM培养基（Gibco），聚肌苷酸(Polynosinic ，PIA，Sigma），新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所），总RNA提取Trizol试剂及逆转录聚合酶链反应（Reverse transcriptionpolymerse chain reaction  RTPCR）试剂盒（北京天根生化科技有限公司）， LOX1兔抗人多克隆抗体（Sata Cruz）；染色体图像分析仪（Leica），梯度PCR仪（Eppendorf公司AG22331型），凝胶图像分析系统（Eppendorf公司AG22331型）；上海捷瑞生物工程有限公司合成下列引物。LOX1mRNA（193 bp）上游引物：TTA CTC TCC ATG GTG GTG CC，下游引物：AGC TTC TTC TGC TTG TTG CC；βactin mRNA(295 bp)上游引物：5TCA CCC ACA ATG TGC CCA TCT ACG A3，下游引物：5CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G3。银杏黄酮苷元（Ginkgetin Aglycone， GA）由贵州省生化中心何照范教授惠赠（主要成分：槲皮素25.75%、山奈酚15.26%、异鼠李素1.77%、总黄酮苷元占总成分含量42.79%），其它试剂均为分析纯。

　　1.2 人脐静脉内皮细胞株ECV304培养

　　人脐静脉内皮细胞株ECV304用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml硫酸链霉素的DMEM培养液培养，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，当细胞生长至80%融合以上时，用体积分数0.25%胰酶消化后，以1∶2或1∶3传代，传代后第2天换液1次，以后每2～3 d换1次液，约3～4 d可长成单层细胞。

　　1.3 实验分组

　　取对数生长期细胞，随机分为对照组（培养基）、oxLDL组（培养基中加入终浓度为50 mg/L的oxLDL后继续培养24 h）、银杏黄酮苷元浓度效应组（GA 6.25 mg/L、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L预先培养48 h，然后加入终浓度为50 mg/L的oxLDL培养24 h）、银杏黄酮苷元时间效应组（GA 25 mg/L预先分别作用6、12、24 h后，加入终浓度为50 mg/L的oxLDL培养24 h）和LOX1拮抗剂组（PIA250 mg/L预先作用2 h后，加入终浓度为50 mg/L的oxLDL培养24 h）。

　　1.4 形态学观察

　　相差显微镜观察各组内皮细胞形态变化。

　　1.5 LOX1mRNA测定

　　样品总RNA提取采用Trizol试剂盒，操作按试剂盒说明进行。A260/A280测定RNA浓度和纯度。采用二步法逆转录试剂盒，将RNA逆转录成cDNA作为模板进行扩增。PCR反应条件均为94 ℃预变形5 min，94 ℃变性30 s，55.4 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循环40次，最后72 ℃延伸10 min，反应终产物立即进行电泳跑胶，凝胶图像分析电泳结果并照相，测定各条带吸光度值。以恒定表达的βactin mRNA作为内参进行校正，计算相对表达量。实验重复3次。

　　1.6 LOX1蛋白表达

　　采用SP免疫组织化学法检测。 用特异性兔抗人LOX1多克隆抗体进行细胞免疫组织化学鉴定，以PBS代替一抗作阴性对照。显微镜下观察并计数，以胞浆和胞膜着色为棕黄或棕褐色颗粒为LOX1蛋白表达阳性细胞，计数阳性细胞数和染色强度累计积分，结果以均数表示。

　　1.7 统计学方法

　　采用SPSS 11.5统计学软件进行分析，数据以（x±s）表示，多组间比较进行方差齐性检验和单因素方差分析（oneway ANOVA），P<0.05表示差异具有显著性。

　　2 结果

　　2.1 人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞

　　与对照组比较，银杏黄酮苷元（≤50 mg/L）对ECV304生长无影响，细胞贴壁生长，黏附紧密，呈典型的铺路石样分布，细胞存活率均大于100%。

　　2.2 LOX1mRNA表达

　　与对照组比较，oxLDL 可明显上调LOX1 mRNA表达，差异显著（P<0.05）。用GA（6.25～50 mg/L）预处理48 h后，均可显著抑制oxLDL诱导内皮细胞LOX1 mRNA表达（P<0.05）；且此效应25 mg/L组>12.5 mg /L组> 6.25 mg/L组（P<0.05），提示此效应有一定浓度依赖性。见图1和图2。
     　　
　　25 mg/L GA预处理细胞6～24 h，均可显著抑制oxLDL诱导细胞LOX1mRNA表达（P<0.05）。药物效应24 h>12 h和6 h组（P<0.05），12 h和6 h组之间差异不显著（P>0.05），提示GA与细胞作用6 h后即可发挥抑制LOX1mRNA表达的作用，该作用在24 h时较强。用LOX1阻断剂PIA对细胞进行预处理2 h，可显著抑制oxLDL诱导的内皮细胞LOX1mRNA表达（P<0.05）。

　　2.3 银杏黄酮苷元对oxLDL诱导的内皮细胞LOX1蛋白表达的影响

　　结果（图3、表1）表明，经oxLDL作用后，内皮细胞LOX1蛋白被大量地诱导表达，与对照组相比，差异显著（P<0.05）。用GA 25 mg/L预处理48 h和LOX1受体阻断剂PIA 250 mg/L预处理2 h，均可完全阻断oxLDL诱导内皮细胞LOX1蛋白过量表达，与oxLDL组比较，P<0.05；与对照组比较，P>0.05。表1  GA对oxLDL诱导内皮细胞LOX1蛋白表达的影响（略）注：(1)与对照组比较，P<0.01 ；(2)与oxLDL组比较，P＜0.01。

　　3 讨论
     　　
　　在AS的形成过程中，oxLDL发挥着重要作用。oxLDL主要通过两种机制促进AS的进展，一是巨噬细胞通过清道夫受体摄入oxLDL，引起血管壁泡沫细胞的堆积和脂质的形成；二是oxLDL改变了内皮的多种功能，包括抑制内皮源性一氧化氮的释放、介导黏附因子的产生、改变与内皮凋亡图3  内皮细胞LOX1蛋白表达结果(SP,×400)
Fig.3  The immunohistochemistry results of LOX1 protein in different groups有关的基因，如bcl1、fas和一氧化氮合酶的表达等[3]。LOX1是一种新发现的oxLDL特异性受体，与已发现的oxLDL受体无同源性，与内皮损伤和功能失调有关。本研究显示，oxLDL可以上调内皮细胞表达LOX1，而LOX1的受体拮抗剂可以阻断oxLDL诱导的LOX1表达，提示LOX1不仅是oxLDL的特异性受体，oxLDL还通过LOX1途径上调LOX1mRNA和蛋白表达，从而增加对oxLDL的摄取及其后的内皮损伤效应。
     　　
　　GBE是目前国内应用较广泛的治疗心脑血管疾病的植物提取物，有效成分主要是黄酮和萜内酯，其中黄酮类包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素等，具有很强的清除氧自由基和抗脂质氧化作用。研究显示，银杏黄酮对心肌缺血再灌注引起的心肌顿抑及相关的室性心律失常、心功能障碍、心肌和血管内皮结构损害均有一定的保护作用[4]，增加内皮细胞增殖、抑制凋亡，促进血管内皮修复[5]；影响一氧化氮合酶表达，改善内皮功能；抑制同型半胱氨酸活化核因子-κB，调节AS炎症反应[6]。但是，GBE中的黄酮95%以黄酮糖苷的形式存在，在人体内代谢时不能通过小肠壁进入到血液，而是被肠腔微生物通过杂环裂解方式降解，从而降低口服利用率。本研究采用的GA系黄酮糖苷经酸水解-重结晶法去除糖链后获得的新型药物，增加了脂溶性和生物利用度，但目前国内外对GA的药理活性研究甚少。
     　　
　　本实验在培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304基础上，发现GA可以明显抑制oxLDL诱导的LOX1mRNA表达，并呈时间、浓度依赖性。免疫组织化学的结果也显示GA显著抑制oxLDL诱导的内皮细胞LOX1蛋白表达，提示GA在基因和蛋白水平均明显抑制oxLDL诱导的LOX1表达，这可能是其抗AS的机制之一。本研究通过体外实验证实GA可以减少oxLDL特异性受体LOX1的表达，揭示了GA可能的抗动脉粥样硬化机制，为GA这类特色药物更好应用于临床提供了实验依据。

【参考文献】
  　　[1]Vita JA，Keaney JF．Endothelial function :a barometer for cardiovascular risk[J]．Circulation，2002（106）: 640-642.

　　[2]Jawahar L，Mehta，Dayuan Li，et al．Identification,regulation and fuction of a novellectinlike oxidized lowdensity lipoprotein receptor[J]．J Am Coll Cardiol，2002（39）：1429-1435.

　　[3]Mukherjes S, Coaxum SD, Maleque M, et al. Effects of oxidized low density lipoprotein on nitric oxide synthetase and protein kinase C activities in bovine endothelial cells[J].Cell MolBiol,2001（6）：1051-1058

　　[4]骆秉铨，冯小平，龙建平，等，银杏叶提取物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].中华医学杂志，1997（4）：301-302.

　　[5]Ren DC, Du GH, Zhang JT. Protective effects of ginkgo biloba extract on endothelial cell against damage induced by oxidative stress[J].Journal of Cardiovascular Pharmacology,2002 （6）：804-814

　　[6]彭海，李颖，银杏提取物对主动脉内皮细胞细胞黏附因子及NKκB表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2007（14）:2772-2775.