维生素E对老年雌性大鼠雌激素及海马芳香化酶表达的影响

邓文龙

维生素E对老年雌性大鼠雌激素及海马芳香化酶表达的影响


[ 10-09-14 11:05:00 ]


作者：孔亚坤 耿秀琴 尹俊杰 姚兰春 周艳红 郭献山


【摘要】  目的 探讨维生素E用于防治绝经后女性中枢神经系统退行性疾病的作用及机制。方法 采用自然衰老雌性大鼠为动物模型，实验组每日注射维生素E 5 mg/kg(小剂量组)、15 mg/kg (中剂量组)、60 mg/kg(大剂量组）（n=8）。采用放免法检测血清雌激素含量，用免疫组化法观察维生素E对海马芳香化酶表达的影响，并与成年大鼠（对照组）对比观察。结果 老年对照组较成年对照组雌激素水平下降，中、大剂量组血清雌激素水平回升（P＜0.05），海马芳香化酶表达阳性细胞数目多、表达强，大剂量组呈强阳性。结论 一定剂量维生素E不仅可以提高血中雌激素水平，而且可以通过增强海马芳香化酶的表达使局部雌激素浓度增加而发挥其神经保护作用。

【关键词】  维生素E；自然衰老大鼠；雌激素；芳香化酶；神经保护

　　【Abstract】  Objective  To investigate the effect of vitamin E (Vit E) on estrogen and expression of aromatase in hippocampus of senile female rats and explore the effect of Vit E on preventing from postmenopausal female central nerve system degenerative diseases and its mechanism. Methods  The animal model was established using senile female rats. Rats in low, middle and high dose of Vit E experimental groups (n=8) were respectively Vit E 5, 15 and 60 mg·kg-1·d-1. The levels of serum estrogen was detected by radioimmunoassay. The expression of aromatase in hippocampus was detected by immunohistochemistry. Results  Compared with adult control group, the estrogen of elderly control group was low. And the estrogen of middle and high dose of Vit E groups were recovered (P＜0.05), the expressions of aromatase in hippocampus from the two groups increased. The expression of aromatase in hippocampus in high dose of Vit E group showed strong positive. Conclusions  Some dose of Vit E may not only elevate the level of serum estrogen, but strengthen the expression of aromatase in hippocampus, increase content of local estrogen and protect the nerve.
   
　　【Key words】  Vitamin E; Senescent rats; Estrogen; Aromatase; Neuronal protection

　　绝经后女性由于卵巢功能减退雌激素减少，导致其靶器官之一的中枢海马异常改变而出现认知功能障碍进而可发展为阿尔茨海默病(AD)，目前国内外临床防治该种退行性疾病，采用雌激素替代疗法，因其副作用，而遭到质疑〔1〕。因此，寻找疗效安全可靠的药物是目前亟待解决的问题。维生素E(VitE)不仅是一种促进性腺功能的酚类化合物，而且是具有多种功能的重要因子〔2，3〕。芳香化酶（ARO）是雌激素合成的限速酶，脑内雌激素的有效质量浓度主要取决于脑局部芳香化酶表达水平〔4〕。本文采用动物实验对照研究观察老年雌性大鼠应用VitE后对血清雌激素水平和海马神经元芳香化酶表达的影响，探讨VitE对于中枢神经系统保护作用及可能机制，为临床防治AD等神经退行性疾病提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物与分组  40只18～20月龄，Wistar老年雌性大鼠，体重(415±20)g，8只4月龄，Wistar成年雌性大鼠,体重(200±20)g，由哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物中心提供。以成年鼠为对照组,将老年大鼠随机分为5组(n=8)：老年对照组、雌激素组（0.2 mg·kg-1·3 d-1）和小、中、大剂量VitE组 (5、15和60 mg·kg-1·d-1)，腹腔注射连续9 w，对照组注射等量的植物油。VitE注射液(上海通用药业股份有限公司)，苯甲酸雌二醇(天津金耀氨基酸有限公司)。

　　1.2  标本的制备  实验终止时，所有大鼠摘眼球取血，4℃冰箱静置8 h，3 000 r/min离心10 min，取上清，用于雌二醇(E2)的测定。随机取5只大鼠用4%多聚甲醛常规灌流固定，快速取脑，延正中矢状裂把脑对称地分为左右两半，自上丘至视交叉节段作3～4 mm冠状连续切片，固定，常规石蜡包埋，用于ARO的测定。

　　1.3  血清E2水平检测  采用放免法，测定时血清样品取100 μl，严格按照试剂盒说明书操作步骤进行，用γ计数仪计数，浓度单位用pg/ml表示。

　　1.4  海马区ARO的表达  采用SABC法。一抗、试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，具体操作按说明书进行，DAB显色，苏木素复染。ARO抗体为兔多克隆抗体，工作浓度为1∶100。用PBS代替一抗作阴性对照。光镜下ARO定位于海马区神经元内质网，胞浆内出现棕黄色颗粒的为阳性细胞。观察海马同一部位的齿状回(×400)，经日本产Moticam1300照相系统采样后，采用北航医学图像分析管理系统进行分析，计算ARO染色阳性细胞的阳性单位值和平均光密度值，分别为表达含量的多少和强度的大小。

　　1.5  统计学处理  数据用x±s表示，采用 SPSS 11.5统计软件包，首先进行方差齐性检验，再行OneWay ANOVA和StudentNewmanKeuls(SNK)检验。

　　2  结果

　　2.1  血清E2水平  与成年对照组〔(14.10±3.25)pg/ml〕比较，老年对照组E2水平〔(5.16±1.51)pg/ml〕下降（P＜0.05），雌激素组E2水平〔(46.35±3.5)pg/ml〕显著升高（P＜0.01）。VitE组E2水平回升，中〔(27.08±3.19)pg/ml〕、大〔(26.81±3.87)pg/ml〕剂量组较老年对照组差异显著（P＜0.05），小剂量VitE组E2水平为〔(20.77±3.18)pg/ml〕；各组E2水平均显著低于雌激素组（P＜0.05）。

　　2.2  海马区芳香化酶的表达  成年对照组阳性细胞数目多，老年对照组ARO表达减弱，阳性细胞数目减少（P＜0.01）。与老年对照组比较，VitE组ARO表达增强，阳性细胞数目增多，中、大剂量VitE组ARO呈强阳性反应，阳性细胞数目多；雌激素组呈阳性反应，阳性细胞数目中等（均P＜0.01）。见图1、表1。

　　表1  各组大鼠海马区ARO的表达（略）

　　与成年对照组比较：1）P＜0.01；与老年对照组比较：2）P＜0.01

　　图1  各组大鼠海马齿状回颗粒细胞层ARO的表达(DAB染色，×400)（略）

邓文龙

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　　3  讨论
   
　　在动物生殖周期研究中发现，啮齿类动物的雌激素波动与人类相似〔5〕。本实验中成年雌鼠卵巢功能处于旺盛时期，雌激素浓度的周期变动是相当明显的，所以本次测定血清E2的浓度有可能处于中等水平。老年雌鼠卵巢退化萎缩、功能衰退，当出现动情周期长、之后持续动情、反复假妊娠时，确认为老年早期鼠，但卵巢仍有一定的内分泌功能，所以血中雌激素浓度降低并可保持一定水平。在卵巢合成分泌E2的“双重细胞学说”过程中，反应均在线粒体中进行。VitE作为抗氧化剂，广泛存在于机体组织细胞线粒体中，可避免过度氧化所造成的线粒体损伤，保护其正常功能。中枢神经系统退行性病变常伴随体内VitE水平的下降或缺失，而适当增加体内VitE的浓度可改善这一状况〔6〕。本实验中，对老年早期的自然衰老雌性大鼠，连续给予不同剂量VitE 9 w，中、大剂量组血清E2水平升高。说明适宜剂量的VitE可起到营养、改善性腺功能的作用，延缓卵巢功能过早衰退，甚至还可能影响肾上腺、脂肪等组织的代偿性反应，从而维持机体内源性雌激素在一定水平，可改善雌激素匮乏而致的中枢神经系统退行性病变。
   
　　ARO主要存在于卵巢、胎盘组织、睾丸、脂肪组织以及脑组织中。在脑组织中ARO分布于与学习和记忆、情绪相关的脑区如基底前脑、海马、豆状核、中脑缝等。ARO是由CYP19基因编码，采用分子生物学的方法敲除小鼠CYP19基因，无论对雄性或雌性小鼠来说，学习记忆能力都受到严重损伤，而切除性腺则对学习记忆的影响较微弱〔7〕。在海马各区及皮质锥体层区域，有报道ARO为弱阳性，甚至有报道在猴脑海马及扣带皮质等区域未检测到ARO mRNA〔8〕。本研究用免疫组化法检测到成年大鼠海马ARO强阳性，这与Kretz等〔9〕的结果基本一致。海马是一个与学习记忆突触可塑性有密切关系的脑区，而大脑皮质是认知的高级整合区，因此，这些脑区内ARO的高表达提示其可能参与了局部雌激素对学习、认知的调节。本实验结果表明VitE可以提高老年雌性大鼠海马ARO的活力，提示海马局部ARO可能通过对底物的催化，使局部雌激素水平增高从而增强空间学习记忆能力。
   
　　体外研究表明，E2及双氢睾酮能够以协同方式诱导成年大鼠脑内ARO的活性〔4〕。本实验发现给予老年雌性大鼠VitE后不仅可使血中雌激素水平升高，而且使海马区ARO表达上调，两者是否有协同作用还是单独作用，还需进一步研究。

【参考文献】
  1 Veiga S，Melcangi RC，DonCarlos LL.Sex hormones and brain aging〔J〕.ExperGeront,2004;39(1112)：162331.

　　2 孔亚坤，姚兰春，卢长柱，等.维生素E对老年雌性大鼠海马区PS1表达和Aβ生成 的影响〔J〕.中国应用生理学杂志，2007；23(2)：23740.

　　3 BrigeliusFlohe R，Kelly FJ,Salonen JT.The European perspective on vitamin E：current knowledge and future research〔J〕.Am J Clin Nutr，2002;76(4)：70316.

　　4 PrangeKiel J，Rune GM.Direct and indirect effects of estrogen on rat hippocampus〔J〕.Neuroscience，2006；138(3):76572.

　　5 吴赛珠.性激素平衡紊乱与疾病〔M〕.北京：人民军医出版社，2005：1201.

　　6 Behl C.Vitamin E and other antioxidants in neuroprotection〔J〕.Int J Vitam Nutr Res，1999；69(3):2139.

　　7 Balthazart J，Ball GF.Is brain estradiol a hormone or a neurotransmitter〔J〕?Neuroscience,2006；29(5):2419.

　　8 GarciaSegura LM，Veiga S，Sierra A.Aromatase：a neuroprotective enzyme〔J〕.Neurobiology，2003；71(1):3141.

　　9 Kretz O，Fester L，Wehrenberg U.Hippocampal synapses depends on hippocampal estrogen synthesis〔J〕.J Neurosci，2004;24(26):591321.

邓文龙

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　　3  讨论
   
　　在动物生殖周期研究中发现，啮齿类动物的雌激素波动与人类相似〔5〕。本实验中成年雌鼠卵巢功能处于旺盛时期，雌激素浓度的周期变动是相当明显的，所以本次测定血清E2的浓度有可能处于中等水平。老年雌鼠卵巢退化萎缩、功能衰退，当出现动情周期长、之后持续动情、反复假妊娠时，确认为老年早期鼠，但卵巢仍有一定的内分泌功能，所以血中雌激素浓度降低并可保持一定水平。在卵巢合成分泌E2的“双重细胞学说”过程中，反应均在线粒体中进行。VitE作为抗氧化剂，广泛存在于机体组织细胞线粒体中，可避免过度氧化所造成的线粒体损伤，保护其正常功能。中枢神经系统退行性病变常伴随体内VitE水平的下降或缺失，而适当增加体内VitE的浓度可改善这一状况〔6〕。本实验中，对老年早期的自然衰老雌性大鼠，连续给予不同剂量VitE 9 w，中、大剂量组血清E2水平升高。说明适宜剂量的VitE可起到营养、改善性腺功能的作用，延缓卵巢功能过早衰退，甚至还可能影响肾上腺、脂肪等组织的代偿性反应，从而维持机体内源性雌激素在一定水平，可改善雌激素匮乏而致的中枢神经系统退行性病变。
   
　　ARO主要存在于卵巢、胎盘组织、睾丸、脂肪组织以及脑组织中。在脑组织中ARO分布于与学习和记忆、情绪相关的脑区如基底前脑、海马、豆状核、中脑缝等。ARO是由CYP19基因编码，采用分子生物学的方法敲除小鼠CYP19基因，无论对雄性或雌性小鼠来说，学习记忆能力都受到严重损伤，而切除性腺则对学习记忆的影响较微弱〔7〕。在海马各区及皮质锥体层区域，有报道ARO为弱阳性，甚至有报道在猴脑海马及扣带皮质等区域未检测到ARO mRNA〔8〕。本研究用免疫组化法检测到成年大鼠海马ARO强阳性，这与Kretz等〔9〕的结果基本一致。海马是一个与学习记忆突触可塑性有密切关系的脑区，而大脑皮质是认知的高级整合区，因此，这些脑区内ARO的高表达提示其可能参与了局部雌激素对学习、认知的调节。本实验结果表明VitE可以提高老年雌性大鼠海马ARO的活力，提示海马局部ARO可能通过对底物的催化，使局部雌激素水平增高从而增强空间学习记忆能力。
   
　　体外研究表明，E2及双氢睾酮能够以协同方式诱导成年大鼠脑内ARO的活性〔4〕。本实验发现给予老年雌性大鼠VitE后不仅可使血中雌激素水平升高，而且使海马区ARO表达上调，两者是否有协同作用还是单独作用，还需进一步研究。

【参考文献】
  1 Veiga S，Melcangi RC，DonCarlos LL.Sex hormones and brain aging〔J〕.ExperGeront,2004;39(1112)：162331.

　　2 孔亚坤，姚兰春，卢长柱，等.维生素E对老年雌性大鼠海马区PS1表达和Aβ生成 的影响〔J〕.中国应用生理学杂志，2007；23(2)：23740.

　　3 BrigeliusFlohe R，Kelly FJ,Salonen JT.The European perspective on vitamin E：current knowledge and future research〔J〕.Am J Clin Nutr，2002;76(4)：70316.

　　4 PrangeKiel J，Rune GM.Direct and indirect effects of estrogen on rat hippocampus〔J〕.Neuroscience，2006；138(3):76572.

　　5 吴赛珠.性激素平衡紊乱与疾病〔M〕.北京：人民军医出版社，2005：1201.

　　6 Behl C.Vitamin E and other antioxidants in neuroprotection〔J〕.Int J Vitam Nutr Res，1999；69(3):2139.

　　7 Balthazart J，Ball GF.Is brain estradiol a hormone or a neurotransmitter〔J〕?Neuroscience,2006；29(5):2419.

　　8 GarciaSegura LM，Veiga S，Sierra A.Aromatase：a neuroprotective enzyme〔J〕.Neurobiology，2003；71(1):3141.

　　9 Kretz O，Fester L，Wehrenberg U.Hippocampal synapses depends on hippocampal estrogen synthesis〔J〕.J Neurosci，2004;24(26):591321.